Arbeitsgruppe Phytoantikörper

Leitung: Prof. Dr. Udo Conrad

 

Die Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit der Produktion rekombinanter Proteine in transgenen Pflanzen und mit einfachen und innovativen Methoden zur Reinigung dieser Eiweiße. Darüber hinaus beschäftigt sich die Arbeitsgruppe mit dem gezielten Abbau von spezifischen Proteinen in Pflanzen, um deren Funktion zu blockieren.

Forschungsschwerpunkte

Ein wichtiger Themenbereich umfasst Arbeiten zum Molecular F(Ph)arming. Ein Schwerpunkt dieser Arbeiten ist die Expression von repetitiven Proteinen in Pflanzen, um auf diese Weise neue Biomaterialien zu erzeugen. Hier stehen Spinnenseidenproteine im Zentrum des Interesses. Während der Evolution haben Spinnen die Produktion und Nutzung sehr verschiedener proteinbasierter Seidenmaterialien perfektioniert. Diese Seidenfasern weisen außerordentliche Eigenschaften auf, die hinsichtlich Festigkeit und Elastizität technische Fasern bei weitem übertreffen. Die Tragfadenseide, von den Spinnen als Haltefaden und als Rahmenfaden ihrer Netze benutzt, weist dabei ganz besondere mechanische Eigenschaften auf: Sie ist fünfmal fester als Stahl und dreimal zäher als Kevlar (p-Aramid), die beste von Menschen hergestellte Kunstfaser. Die Fangfadenseiden, z.B. die flagelliforme Seide, sind weniger fest als die Tragfadenseide, können aber auf das Mehrfache ihrer Länge gedehnt werden, bevor sie reißen. Die Fangfadenseide weist somit eine sehr hohe Elastizität und Dehnbarkeit auf. Sie kann die kinetische Energie der Beute daher sehr gut aufnehmen. Die Arbeiten haben sich deshalb auf die Expression von Hauptbestandteilen der Tragfadenseide, den Proteinen MaSp1 (Scheller et al., 2001) und MaSp2 sowie dem wichtigsten Bestandteil der flagelliformen Seide, dem Protein FLAG, konzentriert. Es wird angenommen, dass die Größe der Tragfadenseidenproteine ein Schlüsselfaktor für die mechanischen Eigenschaften gesponnener Fasern ist, da alle bisher untersuchten Spinnen sehr hochmolekulare Spinnenseidenproteine erzeugen. Aus diesem Grunde steht die Produktion von Spinnenseidenproteinen mit nativer Größe (über 200 kDa) in Pflanzen im Zentrum des Interesses. Als Methode nutzen wir die posttranslationale Verknüpfung in vitro durch Transglutaminase ([link]Weichert et al., 2014) und in vivo durch inteinbasiertes „protein splicing“ ([link]Hauptmann et al., 2013a, [link]Hauptmann et al., 2013b). „Protein splicing“ wurde auch bei der samenspezifischen Akkumulation von stabilen hochmolekularen Spinnenseidenproteinmultimeren benutzt ([link]Weichert et al., 2016). ELPylierte Spinnenseidenderivate erwiesen sich als nicht-cytotoxische und nicht-hämolytische Biopolymere ([link]Hauptmann et al., 2015). Die mechanische Charakterisierung erfolgt durch Kooperationspartner am Fraunhofer IWM Halle ([link]Junghans et al., 2006; Junghans et al., 2008, [link]Weichert et al., 2014, [link]Hauptmann et al., 2013).

 

Ein zweiter Schwerpunkt umfasst die Produktion von therapeutischen Antikörpern und von Vakzinen in Pflanzen. Transgene Pflanzen werden seit 20 Jahren als Produktionsinstrument für therapeutische Proteine genutzt. Insbesondere die Entwicklung skalierbarer und preiswerter Reinigungssysteme stellt eine für die weitere Nutzung dieser Technologie essentielle Bedingung dar. Für beide Klassen von therapeutischen Proteinen wurde ELPylierung als geeignete Methode zur Expressionssteigerung und zur effizienten Reinigung etabliert [link](Floss et al., 2008, [link]Floss et al. 2009a, [link]Floss et al. 2009b, [link]Floss et al. 2010a, [link]Floss et al. 2010b, [link]Conrad et al., 2011, [link]Phan and Conrad, 2011).

Aktuelle Arbeiten zu Vogelgrippeantigenen konzentrieren sich auf die Erzeugung von hochimmunogenen Hämagglutininmultimeren in Pflanzen. Diese Arbeiten erfolgen in Kooperation mit dem Institut für Biotechnologie in Hanoi, Vietnam, mit der Firma NAVETCO, Ho Chi Minh City, Vietnam und mit dem Friedrich-Löffler-Institut auf Riems. Wir konnten zeigen, dass in Pflanzen erzeugte Hämagglutinintrimere potentiell neutralisierende Immunantworten in Mäusen induzieren ([link]Phan et al., 2013). Durch Ausnutzung der S-Tag-S-Protein-Interaktion gelang es uns, in planta Hämagglutininoligomere zu erzeugen, die in Mäusen neutralisierende Immunantworten induzierten (Phan et al., 2917). Deratige Immunantworten konnten mit Rohextrakten aus Nicotiana benthamiana-Pflanzen erzeugt werden. Diese Minimierung des  downstream processing ermöglicht die schnelle Vaccineproduktion bei niedrigen Kosten, wie es für veterinärmedizinische Anwendungen nötig ist. Weiterhin haben wir unter Ausnutzung der Streptag-StrepTactin-Interaktion Oligomere in vitro erzeugt, die ebenfalls

neutralisierende Immunantworten in Mäusen induzierten ([link]Phan et al., 2018).

 

Ein weiterer Schwerpunkt unserer Arbeiten besteht in dem Abbau von spezifischen Proteinen in Pflanzen. Wir haben gezeigt, dass GFP (green fluorescent protein) gezielt in Zytosol abgebaut werden kann (Baudisch et al., 2018). GFP wird durch einen spezifischen Nanobody (VHH) erkannt. Dieser Nanobody ist mit einem F-box-Protein fusioniert. Das F-box-Protein-Nanobody-Fusionsprotein mit dem gebundenen GFP (F-box aus Drosophila melanogaster) wird mit Hilfe pflanzlicher Proteine in das  Proteasom befördert und abgebaut. Das gilt auch für GFP-Fusionsproteine, wie in der Abbildung beim Vergleich von 1a) und 1b) deutlich wird.

In einem ähnlichen Ansatz haben wir den spezifischen Nanobody mit dem Protein BTB (aus humanen Zellen) fusioniert und auf diese Weise ebenfalls den Abbau eines GFP-Fusionsproteins induziert, wie beim Vergleich von 2a) und 2b) deutlich wird. Durch solche Versuche aus dem Werkzeugkasten der synthetischen Biologie streben wir an, ausgewählte Proteinfunktionen sehr gezielt zu unterbinden bzw. die Wechselwirkung mit Pathogenen zu beeinflussen. Wir kooperieren hier mit der Arbeitsgruppe Chromosomenstruktur und –funktion am IPK und der AIPlanta, Neustadt.


Methodische Schwerpunkte

Phage Display Technologie

In der Arbeitsgruppe Phytoantikörper werden rekombinante Antikörper durch Phage Display Screening erzeugt. Hierzu stehen verschiedene Bibliotheken (scFv und VH, VHH) zur Verfügung. Auf diese Weise wurden und werden im Rahmen nationaler und internationaler Kooperationen diverse rekombinante Antikörper erzeugt und charakterisiert. Das beinhaltet rekombinante Antikörper gegen Pflanzenpathogenantigene und gegen Antigene humaner Pathogene als auch rekombinante Antikörper gegen Phytohormone und regulatorische Proteine.

Inverse Transition Cycling 

ELPylierte Proteine können unter Ausnutzung besonderer Eigenschaften von ELP gereinigt werden. Hierzu wird ausgenutzt, dass ELPs in Abhängigkeit von der Salzkonzentration und der Temperatur reversibel ausfallen. Bei niedrigerer Temperatur und ohne Salz lösen sie sich erneut. Die Abtrennung der Präzipitate erfolgt durch Zentrifugation (cITC) oder durch Filtrierung (mITC). Für verschiedene Anwendungen (Spinnenseidenproteine, Vogelgrippeantigene) wurden skalierbare Protokolle entwickelt ([link]Phan and Conrad, 2011, [link]Heppner et al., 2016).