Arbeitsgruppe Hefegenetik

Leitung: Prof. Dr. Gotthard Kunze | [link]Dr. Martin Giersberg (komm.)

Forschungsgebiete

Im Mittelpunkt der Forschung der Arbeitsgruppe Hefegenetik steht die nicht-konventionelle, nicht-pathogene Hefe Arxula adeninivorans und ihre Nutzung als Wirt für die Produktion rekombinanter Proteine, als Gendonor (Spender) und Biokatalysator für neue biotechnologische Produkte bzw. als mikrobielle Komponente für Biosensoren zur Analyse von Abwasser, Urin und Blut, für die Überwachung von Futter- und Nahrungsmitteln und für medizinische Untersuchungen. 

Die Hefe A. adeninivorans wurde bereits in den 80er Jahren für die „Single Cell“ Proteinproduktion in Malchin (Mecklenburg-Vorpommern) eingesetzt, wo sie sich durch ihre Schnellwüchsigkeit, dem Erreichen von außerordentlich hohen Zelltitern und ihrem großen Substratspektrum auszeichnete. Parallel zum biotechnologischem Einsatz erfolgten Untersuchungen zur taxonomischen Klassifizierung und zur Physiologie. Auch Tools für deren genetische Bearbeitung, wie Herstellung von Mutanten durch chemische Mutagenese, Protoplastenfusion und mitotische Segregation wurden in diesem Zeitraum in Kooperation mit der Abteilung Hefegenetik der Universität Greifswald erstellt. All dies war Voraussetzung für die Arbeiten zur Etablierung von A. adeninivorans als Tool zur Produktion neuer biotechnologischer Produkte bzw. zur Konstruktion, Etablierung und Validierung neuer auf A. adeninivorans basierender mikrobieller Biosensoren für die Umwelt- und Lebensmittelüberwachung, die Medizin und Pharmazie, die ab den 90iger Jahren in der Arbeitsgruppe Hefegenetik unter Leitung von Prof. Dr. habil. Gotthard Kunze erfolgten. 

Das Genom von A. adeninivorans

 Zur Erreichung dieser Zielstellung wurde das Genom von A. adeninivorans per DNA-Reassoziationsstudien in den frühen 90iger Jahren detailliert analysiert. Gleichzeitig wurden physiologische Studien bezüglich verwertbarer Substrate als Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquellen durchgeführt und deren Abbauwege untersucht. Dabei gelang auch die Konstruktion erster transgener Arxula-Hefen. In den folgenden Jahren wurden mit der einhergehenden Isolation und Charakterisierung zahlreicher A. adeninivorans-Gene und der 25S rDNA ein Transformations-/Expressionssystem zur Produktion rekombinanter Proteine in transgenen Hefestämmen entwickelt und etabliert. Dieses System wurde zu einer Plattform (bezeichnet als Xplor®2) ausgebaut, mit der sich über die sog. Modulbauweise (Expressionsmodule, Selektionsmarkermodule, ARS-Module, Chaperon-Module) schnell und effektiv die gewünschten Plasmide konstruieren lassen. Um diese Plattform zur Konstruktion maßgeschneiderter transgener Produktionsstämme mit hoher Akzeptanz nutzbar zu machen, wurde sie in enger Zusammenarbeit mit klein- und mittelständischen Unternehmen (KMUs) wie der ARTES Biotechnology GmbH in Langenfeld etabliert. Vorteil dieser vom IPK patentierten Plattform ist, dass nur die für die jeweilige Hefe-Transformande essentiellen und gewünschten Module und weder Resistenzmarker noch E. coli Sequenzen in die Hefe transformiert werden. Da die Plattform ein integratives Transformationssystem ist, d.h. die entsprechenden Kassetten stabil in das Genom von A. adeninivorans integriert werden, weisen die erhaltenen Transformanden eine hohe mitotische Stabilität auf, was Voraussetzung für deren Verwendung in der Biotechnologie ist.

Zur weiteren Steigerung der Attraktivität dieser Plattform wurde am IPK 2010 das vollständige Genom dieser Hefe sequenziert und annotiert.

Entwicklung von Sensoren im Umweltbereich

Auf Grund der Möglichkeit A. adeninivorans sowohl genetisch als auch gentechnisch zu bearbeiten, wurden schon frühzeitig Kooperationen vor allem mit KMUs aufgebaut. U.a. wurden A. adeninivorans-Zellen erstmals als mikrobielle Komponenten für Biosensoren zur Messung des „Biologischen Sauerstoffbedarfs“ (BSB) auf Eignung getestet. Hierbei zeigte sich, dass diese mikrobiellen Biosensoren innerhalb von 70 Sekunden den sog. SensorBSB in Abwasser, Leitungswasser, Brackwasser und Meereswasser bestimmen können. Damit war die Möglichkeit geschaffen, wässrige Proben bezüglich Umweltbelastung zu untersuchen.

 

In den letzten Jahren fokussierten sich die Aktivitäten bezüglich mikrobieller Arxula-Biosensoren auf deren Einsatz im Umweltbereich, in der Landwirtschaft und in der Medizin. So wurde in Zusammenarbeit mit Industriepartnern, Forschungseinrichtungen und Bundesämtern ein Tool an mikrobiellen Biosensoren zur Bestimmung von Hormonen, Dioxin und Pharmazeutika in Leitungswasser, Selterswasser, Abwasser, Urin und Blutserum etabliert. Diese basieren auf transgenen A. adeninivorans Zellen. Sie enthalten die genetische Information für die uneingeschränkte Expression des entsprechenden humanen Rezeptors, der bei Interaktion mit dem entsprechenden Ligand (östrogen-, androgen-, progesteron-, glucocorticoid-wirksame Substanz, Dioxine, Pharmazeutika) interagiert und ein Reportergen einschaltet. Dieses synthetisiert ein rekombinantes Enzym und lässt sich anschließend mit einer einfachen biochemischen bzw. amperometrischen Messung nachweisen. Da die Aktivität des Enzyms direkt mit der Konzentration des entsprechenden Hormons bzw. Pharmazeutikums korreliert, lassen sich alle mit dem entsprechenden Rezeptor interagierenden Substanzen als sog. Summenparameter messen. Erste Assays zur Bestimmung von östrogenen und androgenen Aktivitäten in Leitungswasser, Selterswasser und Abwasser wurden bereits vom Industriepartner kommerzialisiert und nach DIN/ISO als validiertes Testsystem zugelassen. Assays zur Ermittlung von östrogen-, androgen-, progesteron-, glucocorticoid-wirksamen Substanzen, Dioxinen und Pharmazeutika in Urin und Blutserum sind in der Validierung und werden vom Projektpartner Quodata GmbH kommerzialisiert.

Entwicklung von Sensoren im Humanmedizinbereich

Neben dem Einsatz der Hefe A. adeninivorans als mikrobielle Komponente von Biosensoren ist deren Einsatz als Wirt zur Synthese rekombinanter vor allem humaner Rezeptoren geplant. Da auf Grund der Organismus-Spezifität nicht jedes Protein in funktionstüchtiger rekombinanter Form in A. adeninivorans synthetisiert werden kann, wurde die Xplor®2 Transformations-/Expressionsplattform erweitert. Damit lassen sich nun neben A. adeninivorans auch Hefen wie Hansenula polymorpha transformieren und als Produzenten rekombinanter Proteine nutzen. Auf dieser Basis werden derzeit u.a. erste funktionstüchtige rekombinante Rezeptoren (z.B. humaner Östrogenrezeptor α, humaner Progesteronrezeptor) hergestellt. Ihre Einsatzfelder sind neben der Umweltanalytik (Ermittlung von Östrogen/Progesteron und [Anti]östrogen/[Anti]progesteron wirkenden Substanzen) vor allem die Medizin. So wird in Zukunft in Kooperation mit einem Fraunhofer-Institut und Industriepartnern eine Oberflächenplasmonen-Resonanz (SPR) Plattform für die Krebsanalyse (z.B. Brustkrebs – Interaktion von Herceptin mit dem Rezeptor HER2 [neu]) bzw. für die Testung neuer Medikamente auf Interaktion mit den entsprechenden Rezeptor(en) entwickelt.

Hefen als Produzenten neuer rekombinanter Proteine und Biokatalysator für neue biotechnologische Produkte

Parallel wurden und werden transgene Hefen, bevorzugt A. adeninivorans, für folgende biotechnologische Anwendungen konstruiert:

  1. Rekombinante Tannase als Beimischung von Futtermitteln bzw. als Additiv zur Steigerung der Ausbeute in Biogasanlagen.
  2. Herstellung von purinarmen Lebensmitteln über ein enzymatische Verfahren.
  3. Nutzung von A. adeninivorans als Biokatalysator zur Produktion von n-Butanol.
  4. Aufbereitung und Rückgewinnung von Metallen aus Tailings- und Haldenmaterial sowie zur Aufbereitung von Armerzen unter Einsatz von Hefen, wie A. adeninivorans.

Weinkontaminanten Vor-Ort

Nachweis von Weinkontaminanten Vor-Ort per Multiplex-Wein-Stick bzw. im Labor per Multiplex-Makrodot-Assay.  

Ziel eines von der Investitionsbank Sachsen-Anhalt geförderten Vorhabens ist die Entwicklung neuer innovativer biologischer Testsysteme zum schnellen und sensitiven Nachweis von Weinkontaminanten. Hierzu werden durch Übertragung des biologischen Nachweissystems (DNA-RNA-Hybridisierung) auf einen Multiplex-Wein-Stick bzw. Multiplex-Makrodot-Assay im Mikrotiterplattenformat Systeme zum schnellen, sensitiven und eindeutigen Nachweis von Weinkontaminanten für die Weinindustrie etabliert und validiert. Der direkt für Vor-Ort Analysen ausgelegte Multiplex-Wein-Stick soll zukünktig in einer Ja/Nein-Aussage und semi-quantitativen Detektion dem Winzer einen ersten Überblick über die Qualität seines Produktes hinsichtlich Kontamination geben. Bei einer ja-Aussage kan anschließend der für das Labor ausgelegter Multiplex-Makrodot-Assay dieser Plattform als Bestätigungsverfahren zusätzlich.