Einsatz von A. adeninivorans als Biosensor

Auf Grund seiner physiologischen Parameter und der Möglichkeit diese Hefe sowohl genetisch als auch gentechnisch zu bearbeiten, wurden schon frühzeitig Kooperationen vor allem mit KMUs aufgebaut. U.a. wurde in Zusammenarbeit mit der Dr. Bruno Lange GmbH Ende der 90iger Jahre A. adeninivorans-Zellen erstmals als mikrobielle Komponenten für Biosensoren zur Messung des „Biologischen Sauerstoffbedarfs“ (BSB) auf Eignung getestet. Hierbei zeigte sich, dass BSB-Sensoren mit Arxula als mikrobieller Komponente innerhalb von 70 Sekunden den sog. SensorBSB in Abwasser, Leitungswasser, Brackwasser und Meereswasser bestimmen können. Damit war die Möglichkeit geschaffen, wässrige Proben bezüglich Umweltbelastung, d.h. Gegenwart von schnell assimilierbaren Substanzen, zu detektieren. Die in diesem Zeitraum entwickelten mikrobiellen Biosensoren wurden von der Dr. Bruno Lange GmbH in Kombination mit dem ARAS-Gerätesystem vermarktet. Gleichzeitig wurden die mikrobiellen Biosensoren in Hong Kong zur Messung von Abwasser, Brackwasser und Meereswasser eingesetzt. So konnte u.a. der Arxula-BSB-Sensor über ein von der DAAD finanziertes Austauschprogramm vor Ort erfolgreich auf Eignung getestet werden. Der Vergleich der gemessenen SensorBSB-Daten mit denen über konventionelle Methoden erhaltenen (BSB5-Methode mit einer Messzeit von 5 Tagen) belegte die Korrektheit der in nur 70 Sekunden erhaltenen SensorBSB-Messwerte. Die Sensoren werden noch heute an der Hong Kong University of Science and Technology (HKUSC) zur Abwasseranalyse eingesetzt.

 

In den letzten Jahren fokussierten sich die Aktivitäten bezüglich mikrobieller Arxula-Biosensoren auf deren Einsatz im Umweltbereich, in der Landwirtschaft und in der Medizin. So wurde in Zusammenarbeit mit Industriepartnern (quo data GmbH - Dresden, PROLATEK GmbH - Dresden, Gesellschaft für Silizium und Mikrosysteme mbH (GeSiM) – Dresden), Forschungseinrichtungen (Forschungszentrum Rossendorf – Dresden) und Bundesämtern (Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit [BVL – Referenzlabor], Bundesamt für Materialforschung und –prüfung [BAM]) ein Tool an mikrobiellen Biosensoren zur Bestimmung von Hormonen, Dioxinen und Pharmazeutika in Leitungswasser, Selterswasser, Abwasser, Urin und Blutserum etabliert. Diese basieren auf transgenen A. adeninivorans Zellen, die mit dem in der Arbeitsgruppe entwickelten und etablierten Transformations-/ Expressionssystem Xplor®2 konstruiert wurden. Sie enthalten die genetische Information für die konstitutive Expression des entsprechenden humanen Rezeptors, der bei Interaktion mit dem entsprechenden Ligand (östrogen-, androgen-, progesteron-, glucocorticoid-wirksame Substanz, Dioxine, Pharmazeutika) interagiert und ein Reportergen einschaltet, welches ein rekombinantes Enzym synthetisiert, das sich mit einer einfachen biochemischen bzw. amperometrischen Messung detektieren lässt. Da die Aktivität des Enzyms direkt mit der Konzentration des entsprechenden Hormons, Dioxins bzw. Pharmazeutika korreliert, lassen sich alle mit dem entsprechenden Rezeptor interagierenden Substanzen als sog. Summenparameter messen.

 

Folgende Sensoren wurden bisher im Assay-Format auf Basis der konstruierten transgenen A. adeninivorans Zellen etabliert:

A-YES Assay – Assay zu Bestimmung von östrogenen Aktivitäten in Leitungswasser, Selterswasser, Abwasser, Urin und Blutserum.

Der Assay wurde am IPK entwickelt und von der quo data GmbH/Dresden validiert. Zur Messung von Leitungswasser, Selterswasser und Abwasser ist er bereits kommerzialisiert (Vertrieb quo data GmbH) und seit 2018 ein nach DIN/ISO international zugelassenes biologisches Testsystem zum Monitoring von Oberflächengewässern.

 

Mikrobieller Biosensor zur Bestimmung östrogen-wirksamer Substanzen – Messprinzip: Die mikrobielle Komponente des Biosensors umfasst transgene Hefezellen der Art A. adeninivorans. Diese enthalten genomintegriert je eine Rezeptorgen-Kassetten mit TEF1-Promotor – hERα–Gen – PHO5-Terminator und eine Reportergen-Kassette mit GAA-ER6-Promotor – Reportergen – PHO5-Terminator. Der TEF1-Promotor sorgt für die konstitutive Expression des Rezeptorgens, was zur Synthese des rekombinanten Östrogen-Rezeptors α (hERα) führt. Werden die transgenen Zellen mit östrogen-wirksamen Substanzen inkubiert, transaktivieren diese hERα, der dimerisiert als Transkriptionsfaktor wirkt und an die ERE-Region des GAA-ERE-Promoters bindet.  Dies hat die Expression des Reportergens (phyK) zur Folge, was zur Synthese und Sezernierung des Reporterproteins (Phytase) führt, dessen Aktivität messtechnisch erfasst werden kann.

A-YAS Assay – Assay zu Bestimmung von androgenen Aktivitäten in Abwasser, Urin und Blutserum. 

Der Assay wurde am IPK entwickelt und von der quo data GmbH/Dresden validiert. Zur Messung von Leitungswasser, Selterswasser und Abwasser ist er bereits kommerzialisiert (wird von der quo data GmbH vertrieben). Die Validierung des A-YES Assays für Urin und Blutserum wird gegenwärtig durchgeführt.

A-YPRS Assay – Assay zu Bestimmung von progesteronen Aktivitäten in Abwasser, Urin und Blutserum.

Der Assay wurde in den letzten Jahren etabliert und auf Praxistauglichkeit geprüft. Derzeit wird er von der quo data GmbH/Dresden für Abwasser, Urin und Blutserum validiert. Die Kommerzialisierung des A-YPRS Assays erfolgt über die quo data GmbH.

A-YGS Assay – Assay zu Bestimmung von glucocorticoiden Aktivitäten in Urin und Blutserum.

Der Assay wurde in den letzten Jahren etabliert und auf Praxistauglichkeit geprüft. Es ist geplant ihn für Urin und Blutserum zu validieren. Die Kommerzialisierung erfolgt über die quo data GmbH.

A-YDS-Assay - Assay zu Bestimmung von Dioxinen in Urin, Blutserum und Futtermitteln.

Dieser Assay wird derzeit etabliert und auf Praxistauglichkeit geprüft. Er soll für Futtermittel, Urin und Blutserum validiert werden. Die Kommerzialisierung erfolgt über die quo data GmbH.

A-YPS Assay - Assay zu Bestimmung von Pharmazeutika

(z.B. Diclofenac, Chlozapin, Diazepam), die über die Ausscheidungswege von Tier und Mensch in die Umwelt gelangen und dort nur sehr langsam abgebaut werden. Derzeit wird bei der Quodata GmbH seine Praxistauglichkeit geprüft. Auch er soll anschließend für die Messung derartiger Pharmazeutika in Wasser und Abwasser etabliert und kommerzialisiert werden.

Da in der Umweltanalytik nicht nur ein Monitoring dieser Hormone und Pharmazeutika essenziell ist, sondern diese Verbindungen auch effektiv aus Abwasser in Kläranlagen eliminiert werden müssen, ist ein Einsatz der Arxula Hormon- und Pharmazeutika-Biosensoren auch in diesem Anwendungsbereich geplant. So werden derzeit sowohl östrogen- und an-drogen-wirksame Substanzen als auch Pharmazeutika über Ozonisierung aus dem Abwasser entfernt. Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, dass bei nicht ausreichender Ozonisierungszeit noch nicht vollständig zerstörte Verbindungen im Abwasser vorliegen können, die vielmals eine weit höhere Hormonaktivität bzw. Pharmazeutika-Reaktion als die entsprechende Ausgangssubstanz aufweisen. Um derartige negative Effekte auszuschließen und zusätzlich einen effektiven Einsatz der energieintensiven Ozonisierung zu gewährleisten, ist eine Kopplung von mikrobiellen Arxula-Biosensoren zur Bestimmung von Östrogenen, Androgenen und spezifischen Pharmazeutika mit der Ozonisierungsanlage geplant. Dazu sind die auf A. adeninivorans basierenden mikrobiellen Komponenten vom A-YES, A-YAS und A-YPS Assay für amperometrische Messungen auszulegen. Hierzu werden die Hefezellen in immobilisierter Form in einer temperierten Messzelle mit Elektrode gebracht, die Bestandteil einer bereits als Prototyp vorliegenden Messeinrichtung (EstraMonitor) ist. Diese, von den KMUs quo data GmbH/Dresden und PROLATEK GmbH/Dresden konstruierte Messeinrichtung ist zur On-line-Messung von Hormonen und Pharmazeutika mittels amperometrischer Messmethode geeignet. Um Vor-Ort Messungen an Kläranlagen durchführen zu können und alle Anforderungen des Gentechnikgesetzes zu erfüllen, wurde in Absprache mit den Gentechnikbehörden von Sachsen-Anhalt und Nordrhein-Westfalen zusätzlich eine Inaktivierungseinheit zur Abtötung alles lebenden Materials in die Messeinrichtung integriert.

 

Mit dem EstraMonitor wurden bereits amperometrische Messungen von östrogen-wirksamen Substanzen am IPK und bei den Kooperationspartnern quo data GmbH in Dresden bzw. dem Institut für Energie und Umwelttechnik e.V. (UITA) in Duisburg durchgeführt. Genehmigungsverfahren für erste Testeinsätze an einer Kläranlage mit Ozonisierungseinheit im Raum Duisburg sind postitv abgeschlossen. Ziel ist, mit diesem Monitor erstmals ein On-line-Messsystem zur Verfügung zu haben, mit dem sich Umweltbelastungen wie hormon-wirksame Substanzen und Pharmazeutika semi-kontinuierlich detektieren lassen und das bei Überschreitung vorgegebener Grenzwerte deren Eliminierung über eine Ozonisierungsanlage steuert. Hierzu muss das System in den nächsten Jahren bezüglich Messeinrichtung als auch geeigneter Hefekomponenten weiter verbessert werden.

 

 

Ein weiteres momentan laufendes Projekt beschäftigt sich mit der in vitro Testung von pharmazeutischen Substanzen und deren Abbauprodukten in Hinblick auf die funktionelle Bindung an humane Rezeptoren. Ziel ist es ein schnelles Screening Verfahren zu entwickeln, welches Bestandteil der Charakterisierung unterschiedlicher Substanzen (Hormone, Inhibitoren, Aktivatoren) im Rahmen der Entwicklung potentieller Pharmazeutika ist. Hierzu werden humane Rezeptoren, die im natürlichen System nach Bindung eines Liganden dimerisieren mit gesplitteten Fluoreszenzproteinen oder Enzymen fusioniert. Bei  Dimerisierung durch Ligandenbindung erfolgt eine Komplementation des Reporters und folglich ein zu detektierendes Messignal.