Mikrobielle Produktion von Proteinen

Neben dem Einsatz der Hefe A. adeninivorans als mikrobielle Komponente von Biosensoren ist deren Einsatz als Wirt zur Synthese rekombinanter vor allem humaner Rezeptoren geplant. Hierzu wird auf die etablierte, patentierte Xplor®2 Transformations-/Expressionsplatt-form zurückgegriffen. Da auf Grund der Organismus-spezifischen post-transkriptionellen und post-translationellen Proteinmodifikationen nicht jedes Protein in funktionstüchtiger rekombinanter Form in A. adeninivorans synthetisiert werden kann, wurde die Plattform als sog. „Wide Range“ Transformations-/Expressionsplattform erweitert. Mit ihr lassen sich nun neben A. adeninivorans auch Hefen wie Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus und Schwanniomyces occidentalis transformieren und als Produzenten rekombinanter Proteine nutzen. Auf dieser Basis werden derzeit u.a. erste funktionstüchtige rekombinante Rezeptoren (z.B. humaner Östrogenrezeptor α, humaner Progesteronrezeptor, HER2 [neu]) synthetisiert. Ihre Einsatzfelder sind neben der Umweltanalytik (Ermittlung von Östrogen/Progesteron und [Anti]östrogen/[Anti]progesteron wirkenden Substanzen) vor allem die Medizin. So wird derzeit im Rahmen einer Kooperation mit dem Institut für Werkstoff- und Strahltechnik/Dresden und der Gesellschaft für Silizium und Mikrosysteme mbH (GeSiM)/Dresden eine Oberflächenplasmonen-Resonanz (SPR) Plattform mit einem ersten Rezeptorchip auf der Basis des humanen Östrogenrezeptors α etabliert, mit dem sich Rezeptor Ligand Interaktionen messen lassen. Parallel wird diese Plattform für die Krebsanalyse (z.B. Brustkrebs – Interaktion von Herceptin mit HER2 [neu]) bzw. für die Testung neuer Medikamente auf Interaktion mit den entsprechenden Rezeptor(en) eingesetzt werden.

 

Parallel ist der Einsatz transgener Hefen, bevorzugt A. adeninivorans, für folgende biotechnologische Anwendungen geplant:

Tannase als Supplement von Futtermitteln bzw. als Additiv zur Steigerung der Biogasausbeute.

Hierzu wurden die entsprechenden transgenen A. adeninivorans Stämme bereits konstruiert. Versuche mittels „fed-batch“ Fermentation belegen die Eignung dieser Hefestämme als Tannaseproduzent. Die dabei erreichten Ausbeuten (51900 U L-1) gehen weit über die bisher erreichten Ausbeuten mit Wildtyp-Hefen und Pilzen hinaus. Der transgene Arxula-Stamm wurde an die ASA Spezialenzyme GmbH in Wolfenbüttel zwecks kommerzieller Herstellung von Tannase übergeben. 

Herstellung von purinarmen Lebensmitteln über ein enzymatisches Verfahren.

Purinarme Lebensmittel sind vor allem für Gichtpatienten essentiell. Zur Etablierung des enzymatischen Purinabbau-Verfahrens wurden die Gene aller für den Abbau von Purin verantwortlichen Enzyme (Purinnukleotid phosphorylase, Adenin deaminase, Xanthin oxidase, Guanin deaminase, Uratoxidase) isoliert und über einen transgenen Ansatz in A. adeninivorans exprimiert, um als rekombinante Enzyme in hohen Konzentrationen verfügbar zu sein. Die ersten Hefestämme zur Produktion von Adenin deaminase, Uratoxidase und Guanin deaminase wurden bereits dem Industriepartner ASA Spezialenzyme GmbH/Wolfenbüttel zwecks Kommerzialisierung zur Verfügung gestellt. Die Stämme zur Produktion von Purinnukleotid phosphorylase und Xanthin oxidase sind derzeit in Arbeit.

Nutzung von A. adeninivorans als Biokatalysator zur Produktion von n-Butanol. 

n-Butanol wurde bereits in den 20iger/30iger und 40iger Jahren als alternativer Kraftstoff genutzt. Mit der immer größeren Verknappung von Erdöl und der damit im Zusammenhang stehenden Verteuerung von Kraftstoffen ist n-Butanol auf Grund seines Energiewertes und des besseren Transportes den derzeit auf dem Markt befindlichen Biokraftstoffen mit Ethanolzusatz weit überlegen. Problem ist die Verfügbarkeit von n-Butanol, das bisher von Bakterien, die ausschließlich unter streng anaeroben Bedingungen kultivierbar sind, produziert wird. Die damit erreichbaren Maximalausbeuten liegen wegen der geringen Butanoltoleranz des Bakteriums bei ca. 3%. Zusätzlich entsteht noch Acetat als nicht gewünschtes Nebenprodukt, das sich nur schwer von n-Butanol trennen lässt. Wegen der Robustheit der Hefe A. adeninivorans und der damit im Zusammenhang stehenden Butanoltoleranz, des vollständig sequenzierten Genoms und der Möglichkeit diese Hefe sowohl genetisch als auch gentechnisch zu bearbeiten wurde Arxula als potentieller Biokatalysator für eine n-Butanolproduktion ausgewählt. Nach Einfügen der für die Butanolsynthese notwendigen bakteriellen Gene konnte ein erster transgener Hefestamm konstruiert werden, der unter nicht-optimierten Wachstumsbedingungen n-Butanol in geringen Konzentrationen synthetisiert. Dieser Stamm soll in den nächsten zwei Jahren mittels sog. Pathway- und Kultivierungsoptimierung soweit verbessert werden, dass er n-Butanol im ökonomischen Maßstab produziert. Um auch hier eine schnelle Umsetzung der Hefen vom Labor zum Anwender zu gewährleisten, wurden bereits erste Industriepartner (ACS Agrochemische Systeme GmbH/Homburg, Jäckering Mühlen- und Nährmittelwerke GmbH/Hamm) in die Arbeiten involviert. Da die Fermentation unter sog. semi-anaeroben Bedingungen durchgeführt werden, um für die n-Butanolsynthese genügend Koenzym zur Verfügung zu haben, wird die notwendige Kultivierungsoptimierung der transgenen Hefe von Biotechnologen der Hochschule Anhalt in Köthen übernommen.

Mikrobielle Produktion von p-(HB-HV)-Copolymeren aus stärkehaltigen Nebenprodukten

Biobasierte, biologisch abbaubare Kunststoffe stehen seit vielen Jahren vermehrt im Blickpunkt der Öffentlichkeit, eine Reihe derartiger Kunststoffe hat sich bereits auf dem Markt etabliert. Eine wichtige Gruppe stellen dabei die durch Bakterien und Pilze aus Zucker sowie Stärke hergestellten Polyhydroxyfettsäuren (PHF) dar. Wir nutzen die Hefe Arxula adeninivorans zur Produktion von Polyhydroxybuttersäure (PHB) und Poly(3-hydroxybuttersäure-co-3-hydroxyvaleriansäure) (P-(HB-HV)), einem Copolymer, das sich durch eine erhöhte Flexibilität im Vergleich zu reinem PHB auszeichnet. Durch die heterologe Expression der kodierenden Gene für vier Komponenten des PHF-Pathways und die Optimierung der Kultivierungsbedingungen gelang uns dabei eine stabile Akkumulation des Copolymers in den Hefezellen bei einem Anteil von über 50 Prozent am Trockenzellgewicht.

Da das erzeugte P-(HB-HV)-Copolymer ein intrazellulär akkumuliertes Produkt ist, beinhalteten unsere Arbeiten auch die Aufarbeitung des Produktes aus der fermentativ erzeugten Hefe-Biomasse. Dabei wurden für den Zellaufschluss unterschiedliche enzymatische und physikalische Aufschlussverfahren angewendet, z.B. wurden eine Ausschwingmühle in Verbindung mit Silica-Kügelchen bzw. ein Hochdruck-Homogenisator (HDH) eingesetzt. Zur Isolation des Copolymers aus dem Gemisch von Produkt und zellulären Komponenten wurden verschiedene chemische Extraktionsmethoden bzw. Lösungsmittel auf ihre Eignung untersucht. Die besten Ergebnisse wurden erreicht, wenn per HDH aufgeschlossene Biomasse mittels Chloroform extrahiert und anschließend mit kaltem Ethanol gefällt wurde. Es ließ sich damit eine Reinheit von 94,6 Prozent erreichen, dabei lag der Anteil des für die Materialeigenschaften entscheidenden PHV bei 25,6 Prozent. Die Analyse der Produkte erfolgte dabei per Gaschromatographie / Massenspektrometrie (GC/MS), Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) und Dynamischer Differenzkalorimetrie (DDK).

Unser Industriepartner Jäckering Mühlen- und Nährmittelwerke GmbH/Hamm hat für die angestrebte Produktion von P-(HB-HV)-Copolymeren bereits eine Testanlage im Technikumsmaßstab errichtet. Die infrastrukturelle Ausstattung der Halle ermöglicht auch eine Versorgung mit Substraten, die als Nebenprodukt der industriellen Stärkeproduktion anfallen. Auch die technische Ausstattung der Anlage wurde bereits beschafft und installiert.

Konversion von 5-Hydroxymethylfurfural zu 2,5-Furandicarbonsäure

2,5-Furandicarbonsäure (FDCA) ist eine biobasierte Alternative zur petrochemisch produzierten Terephtalsäure, welche zur Herstellung von Polyethylenterephthalat (PET) und Polyestern für die Verpackungs- und Textilindustrie verwendet wird. Somit besteht ein großer Markt für diese Plattformchemikalie. Bis zum heutigen Tag ist kein wirtschaftlicher Prozess zur Herstellung von FDCA bekannt, weder auf chemischer noch auf biotechnischer Basis.

Unser Fokus liegt auf dem Einsatz sicherheitstechnisch unbedenklicher biologischer Systeme basierend auf den nicht-pathogenen Hefen Arxula adeninivorans und Hansenula polymorpha. Diese wollen wir mit maßgeschneiderten Enzymen ausrüsten, die ausgehend vom Rohsubstrat 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) die Reaktion zum FDCA katalysieren. Dazu werden zwei Ansätze verfolgt: Erstens die mikrobielle Synthese einer intrazellulären bakteriellen HMF-Oxidase (HMFO) und zweitens die Synthese einer gentechnologisch maßgeschneiderten Arylalkoholoxidase (AAOm).

Von den selektierten bzw. mutagenisierten HMFO- und AAOm-Genen werden dafür nach Amplifikation Expressionsmodule (TEF1-Promotor - HMFO-/AAOm-Gene – PHO5-Terminator) erstellt und mit Hilfe der Xplor®2-Transformations/Expressionsplattform via „Yeast rDNA Integrative Expression Cassettes“ (YRCs) stabil in die Genome der Hefen A. adeninivorans und H. polymorpha integriert. Die erzeugten mitotisch stabilen transgenen Hefestämme werden anschließend auf Akkumulation an aktiven rekombinanten AAOm bzw. HMFO analysiert. Die Stämme mit den höchsten Akkumulationswerten (AAOm – extracellulär, HMFO – intracellulär) werden anschließend bezüglich Kultivierungsbedingungen optimiert, um maximale AAOm- bzw. HMFO-Akkumulationen zu erreichen.

Beide Enzyme sollen sowohl in freier als auch in immobilisierter Form untersucht werden. Parallel soll die intrazellulär gebildete HMFO auch im Rahmen der Ganzzellkatalyse eingesetzt werden, wodurch auf eine aufwändige Enzymreinigung verzichtet werden könnte.