Konfokalmikroskopie

 

Das Konfokale Laser Scanning Mikroskop Zeiss LSM 510 META und das Spinning Disk Laser Mikroskop System Andor Revolution® XD bietet die Möglichkeit "optische Schnitte" von fixierten und frischen Präparaten zu erstellen. Durch 3-D Rekonstruktion einer Schnittserie (Z-Stapel) können somit u. a. größere Strukturen oder Kompartimente visualisiert werden. Die zelluläre Lokalisierung von Organellen oder Molekülen erfolgt vor allem durch die Detektion von Fluorophoren, die durch immuncytochemische oder molekularbiologische Methoden an das gesuchte Molekül gekoppelt wurden. 

Pflanzenzellen enthalten eine Vielzahl autofluoreszierender Stoffe, deren Emissionspektrum sehr oft  mit verwendeten Fluorophoren überlappt und somit eine spezifische Signaldetektion oftmals erschwert oder sogar verhindert. Das LSM 510 META ermöglicht durch die Verwendung eines optischen Gitters die genaue Trennung von ähnlichen Fluoreszenzemissionen mit Hilfe des sogenannten META-Detektors. Die Erfassung der Spektralsignatur für jeden einzelnen Pixel  des gescannten Bilds ermöglicht die Trennung der einzelnen Fluoreszenzsignale. Weitere technische Neuerungen wie Multitracking, Lamda-Scan oder die stufenlose Einstellung der Laserintensität durch Acousto-Optical Tunable Filter (AOTF) bewirken eine weitaus schonendere Signaldetektion und somit eine Erhöhung der Zellvitalität der zu untersuchenden Organismen. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die Anwendung von FRET,  Ca2+-Imaging, Time Laps Imaging, 3-D Rekonstruktion, sowie die Detektion schwacher und sensibler Fluoreszenzsignale. Weiterhin lassen sich unter anderem Genexpressionsprodukte sowie Änderungen von pH-Werten oder bestimmter Ionenkonzentrationen durch Verwendung spezifischer Fluoreszenzfarbstoffe auf zellulärer Ebene erfassen. 

 

In den letzten 10 Jahren kam es im Bereich der Mikroskopie aufgrund einer Reihe von technologischen Neuerungen zu einer rasanten Neu- und Weiterentwicklung des zellbiologischen Methodenspektrums. Signifikante Verbesserungen bei der Anregung und Detektion von Fluoreszenzsignalen (Detektionsgeschwindigkeit, Quanteneffizienz), aktivierbare Fluorophore und eine verbesserte Auflösung bieten neue Aspekte der modernen Mikroskopie.

 

Im Besonderen gilt dies für das Live Cell Imaging.  Durch die Verwendung der Yokogawa Spinning Disc Einheit, können mit dem Andor Revolution® XD, im Gegensatz zur der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie (=Punktscanner), anstatt einem 1000 Bildpunkte simultan angeregt und somit bis zu 30 Bilder/Sekunde detektiert werden (LSM 510 META 1 Bild/Sekunde). Mit eine Quanteneffizienz von 94 % (gegenüber 25 % beim LSM 510 META) kombiniert das Spinnning Disk hohe Detektionsgeschwindigkeit mit stark reduziertem Photobleaching, wichtig für das Life Cell Imaging von Zeitserien, schnellen dynamischen zellulären Prozessen sowie der Detektion von schwachen Fluoreszenzsignalen in optimierter 3D-Auflösung.

 

Die beiden Konfokalmikroskope bieten somit  für die Erforschung der Mechanismen primärer und sekundärer Stoffwechselvorgänge viele konzeptionelle Ansatzpunkte, zumal mit Hilfe molekularbiologischer Methoden geeignete Fluoreszenzmarker selbst oder als Fusionsprodukt routinemäßig in bestimmten Gewebebereichen expremiert werden können. 

 

Mikroskope:

 

Konfokales Laser Scanning Mikroskop Zeiss LSM 510 META mit 8 Laserlinien (351nm, 361nm, 458nm, 477nm, 488nm, 514nm, 543nm, 633nm) und Zeiss AxioCam HRc.     

 

Konfokales Laser Scanning Mikrsokop Zeiss LSM 780 mit 6 Laserlinien (405nm, 451nm, 488nm, 514nm, 543nm, 633nm)

 

Spinning Disk Laser Mikroskopie System Andor Revolution® XD mit 6 Laserlinien (405nm, 488nm, 514nm, 561nm, 640nm) und 3 CCD Kameras (Andor iXon DU-897-BV, Andor Clara, Andor Neo sCMOS)